¿Cómo se ve la hibridación del cebador y, en consecuencia, la amplificación por PCR afectada por la deleción o inserción de un solo nucleótido dentro del cebador?
Imagine un cebador como este: GCGTCATAAAGGGGACGTG (cebador)
y a la parte correspondiente de la plantilla de ADN le falta una G, por lo que se ve así:
GCGTCATAAAGGGACGTG (plantilla).
El posible emparejamiento podría ser
Cebador GCGTCATAAAGGGGACGTG
Plantilla GCGTCATAAA_GGGACGTG
o
Cebador GCGTCATAAAGGGGACGTG
Plantilla GCGTCATAAAGGG_ACGTG
o cualquier cosa intermedia.
¿Es posible que la amplificación con dicho cebador se interrumpa por completo en la PCR en tiempo real normal a una hibridación de 60 ° C? ¿Podría esto interrumpir por completo la amplificación?
Si el desajuste fuera de sustitución , estaría bastante seguro de que el cebador aún sería funcional y se produciría la amplificación. En el caso extremo, sería al menos una amplificación residual en Ct tardío. Hay muchos datos sobre cómo los desajustes de sustitución afectan a los primers y también tengo mucha experiencia personal con eso.
Desafortunadamente, las discrepancias de eliminación están menos estudiadas y a prueba de Google. La única indicación que he encontrado es este trabajo:
Lipsky RH, Mazzanti CM, Rudolph JG, Xu K, Vyas G, Bozak D, et al. Análisis de fusión de ADN para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido. Clin Chem. 2001; 47: 635-44.
En ese trabajo, la deleción de un solo nucleótido tuvo un efecto similar o menor en la temperatura de fusión que el desajuste de sustitución. Pero se trataba de oligos más largos. Ejemplos:
Efecto de la deleción:
Fragmento de 133 pb, 67% GC, SNP de deleción en la posición 43, delta Tm (homo-heterodúplex) = 1.2 ° C
Efectos de las sustituciones:
Fragmento de 152 pb, 43% GC, sustitución T por C en la posición 68, delta Tm (homo-heterodúplex) = 0,9 ° C
Fragmento de 100 pb, 41% GC, sustitución T por C en la posición 42, delta Tm (homo-hetero dúplex) = 1,4 ° C
Fragmento de 163 pb, 60% GC, sustitución C por T en la posición 86, delta Tm (homo-heterodúplex) = 2,2 ° C
Fragmento de 110 pb, 59% GC, sustitución G por A en la posición 66, delta Tm (homo-hetero dúplex) = 3.8 ° C
Preguntas :
1. ¿Puede recomendarme literatura sobre cómo los desajustes de deleción dentro (¡no al final de!) Los cebadores afectan el recocido y la PCR?
2. ¿Adivinaría que la cartilla en mi ejemplo seguirá siendo funcional, al menos en parte, o no esperaría ninguna amplificación?
EDIT después de sus entradas:
Esta aplicación en línea "mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state -fusión "piensa, los desajustes por deleción son más desestabilizadores que las sustituciones, al menos para los cebadores cortos. Para mi propio ejemplo, calculó delta Tm (homo-heterodúplex) = 12.9 ° C.Si en su lugar pruebo desajustes de sustitución, delta Tm (homo-heterodúplex) está en el intervalo de 3,8 ° C a 5,7 ° C.
Nueva pregunta
Si tiene una experiencia lo más similar posible a mi caso, que es un cebador de 19 nt de largo con deleción de un solo nucleótido en la plantilla de comentarios en la posición cca 6 - 9 desde el extremo del cebador 3 ', temperatura de recocido utilizada a 60 ° C, avíseme si logró la amplificación o no. Por favor, dame una referencia respectiva, si la tienes, así que la citaré en mi reseña :-).
Además, todavía estoy interesado en información general, siempre y cuando el tema sea lo suficientemente estrecho para tratarse de deleciones o inserciones de un solo nucleótido en cebadores. (No coincidencias de sustitución).